Whakatokia kete PCR tika
Cat Nama: HCR2020A
He pai te Kete PCR Tiaki Tiaki mo te whakakaha tika i nga rau tipu, nga kakano, me etahi atu, ka taea te whakamahi mo te tirotiro teitei o nga tauira tipu kaore he polysaccharides me te polyphenols.Ko te DNA polymerase whakakaha tika i runga i te kukuwhatanga kua whakatauhia he pai ake te manawanui ki te aukati PCR i roto i nga tipu.I tenei wa, kei te pupuri i te mahi whakakaha teitei, e tika ana mo te whakanui i nga wahanga DNA i roto i te 5 kb.Ko te Lysis buffer A kei roto i te kete ka taea te whakamahi ki te lyse i nga kopa tipu hou, tio ranei.He ngawari ki te whakahaere, ka taea te whakamahi i te lysate hei tauira mo te whakanui me te kore e purea.Kei roto i te punaha he maataki whakamarumaru e taea ai te whakakaha pai i nga tauira marumaru i muri i te whakatoo me te rewa.2 × Plant Direct Master Mix me taapiri noa nga tohu tuatahi me nga tauira hei mahi i te tauhohenga whakakaha, ma reira ka whakaiti i nga mahi paipa me te whakapai ake i te whakaputanga me te whakahoki ano o nga hua.
Waehanga
| Waehanga | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Whakatokia Raihana Tika Tiaki A | 5 ml | 20 ml |
| Tiaki Whakaraunga Tika Tiaki B* | 5 ml | 20 ml |
*Ko te Plant Direct Lysis Buffer B he reagent whiriwhiri, ka whakamahia hei whakakore i te Plant Direct Lysis Buffer A hei whakaroa i te wa rokiroki o nga tauira.Ka taea te whakamahi kia rite ki te ahuatanga.
Nga Tikanga Rokiroki
2 × Whakaranu Kaiwhakaako Tika Whakatipu, rongoa ki te -30 ~ -15 ℃ me te karo i te tio me te whakamaroke tonu;Whakatokia te Kaipupuri Lysis Tika, rongoa ki te -30 ~ -15 ℃, 2 ~ 8 ℃ ranei.
Tukanga Whakamatau
Tukatuka Tauira–Rau tipu
Tikanga tika:E taunaki ana kia whakamahia nga rau taitamariki.Whakamahia he kohao kohao me te 0.5 – 3 mm te diameter kia whiwhi i tetahi tauira iti me te rite, katahi ka taapiri tika i te tauira ki te punaha PCR (e taunaki ana te punaha 50 μl).Kia mahara, kia mohio kei roto te tauira i te otinga PCR, kaua ki te pakitara ngongo.Mena ka whakamahia te PCR tika ki te whakanui i nga kongakonga roa me nga tauira uaua, ma te whakamahi i te tauira he iti ake te diameter (0.5 – 1 mm) hei tauira ka taea te whiwhi hua pai ake.
Tikanga lysis huri:E taunaki ana kia whakamahia nga rau taitamariki.Tangohia tetahi wahi iti o te rau (tata ki te 1 - 3 mm te whanui), tuu ki roto i te 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, ka huri i nga mea e taea ana (ka taea tenei taahiraa ma te kotēhia te rau ki te 100 μl pipette tip. hei penupenu i te tauira).Mena ka whakamahia te rahi o te kiko rau (kaua e neke ake i te 7 mm), whakanuia te rōrahi o te waimeha ki te 50 μl.I muri i te whakamaroketanga o nga rau, me ahua kaakaariki te otinga.I muri i te poto o te centrifugation, tāpirihia te 1 μl o te supernatant ki te punaha PCR hei tauira tauhohengac.
Tikanga waiariki lysis:E taunaki ana kia whakamahia nga rau taitamariki.Tangohia tetahi wahi iti o te rau (tata ki te 1 – 3 mm te whanui), tuu ki roto i te 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ka whakamahana i te 95°C mo te 5 – 10 min.Ka taea te whakaroa i te wa lysis mo nga rau uaua ki te lyse (kaua e neke ake i te 20 min).Mena ka whakamahia te rahi o te kiko rau (kaua e neke ake i te 7 mm), whakanuia te rōrahi o te waimeha ki te 50 μl.I muri i te whakamahana, whakahiatohia poto, ka tapirihia te 1 μl o te supernatant ki te punaha PCR hei tauira tauhohengab.
Tukatuka Tauira–Kakano Whakato
Tikanga lysis huri:Whakamahia he scalpel hei tapahi i nga kakano me te 5 mm te diameter, ka tapiri atu ki te 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, ka huri i te tauira ki te pito paipa me etahi atu taputapu.Vortex poto ka waiho i te pāmahana rūma mo te 3 - 5 min.Me mohio kei te rukuhia te tauira kakano ki roto i te parepare waimeha.I muri i te centrifugation poto, tāpiri 1 μl o te supernatant ki te pūnaha PCR hei tauira tauhohenga.
Tikanga waiariki lysis:Whakamahia he scalpel hei tapahi i nga kakano me te diameter o te 5 mm, whakauruhia ki te 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, ka whakamahana i te 95°C mo te 5 - 10 min.Ka taea te whakaroa i te wa lysis mo nga rau uaua ki te lyse (kaua e neke atu i te 30 min).I muri i te whakamahana, whakahiatohia poto, ka tapirihia te 1 μl supernatant ki te punaha PCR hei tauira tauhohengab.
a.Ka taea hoki te whakamahi he kutikuti, etahi atu taputapu ranei hei tapahi tauira e tika ana te rahi;ki te whakamahia ano te kutikuti, te kutikuti ranei, me horoi ki te 2% wairewa konutai hypochlorite i mua i ia whakamahinga kia kore ai e poke te whakawhiti i waenga i nga tauira.
b.Me mohio kua tino rewa te Plant Direct Lysis Buffer i mua i te whakamahi.Mēnā he mātotoru te pūreirei, he tāhekeheke rānei, ka taea te whakawera i te 37 ℃ kia rewa katoa i mua i te whakamahi.
c.Ko te rōrahi o te tātauira i roto i te pūnaha tauhohenga ka taea te whakatika tika i runga i te rerekētanga o te rōrahi o ngā mea tipu me te waimeha tāpiri.
Whakatokia Raihana Tika Tiaki
Ko te Plant Direct Lysis Buffer A kei roto i tenei hua kua tino arotau ki te tuku i te ira o te nuinga o nga kopa tipu, he pai hoki mo te wa poto mo te rokiroki i nga tipu mawhero i te 4 ℃.Mena me penapena te tauira mo te wa roa (hei tauira, 1 – 2 marama), ka tūtohu kia whakawhitia te supernatant ki te ngongo EP hou ka penapena ki te -20 ℃.Kia pai ake te penapena i nga tauira, taapirihia he rōrahi rite o te Plant Direct Lysis Buffer B ki te supernatant kua whakawhitia, uru pai ka penapena ki te -20 ℃.He rereke te wa rokiroki me nga tauira tipu me nga ahuatanga.
Pūnaha Tauhohenga
| ddH2O | Ki te 20.0 µl | Ki te 50.0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Pūmatua 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Pūmatua 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| He tauira tangohanga rau tipu(Tirohia ki te Tukatuka Tauira) | 0.5 – 3 mm te kōpae rau/x µl | 0.5 – 3 mm te kōpae rau/x µl |
a.Kei roto Mg2+i te kukū whakamutunga o 2 mM.
b.E taunaki ana kia whakamahia te kukū whakamutunga o te 0.4μM mo ia tuatahi.Ko te nui o te whakamahi i nga mea tuatahi ka piki ake te whakanui kore motuhake.
c.Ko te nui o te tauira e whakamahia ana ka taea te whakarite kia rite ki te ahuatanga.Ko te nui i whakamahia i roto i te tauhohenga kotahi o te tauira lysed masivesivá taea te whakarite i waenganui i 2% - 20% o te tapeke rōrahi o te tauhohenga.Ma te nui rawa o nga tauira ka rahua te whakakaha.
Kaupapa Tauhohenga
| Nga hikoinga | Te pāmahana | Te wa |
| Whakahekenga Tuatahi | 98℃ | 5 min |
| Te whakahekenga | 95℃ | 10 hēkona |
| Te whakaene | 58 ~ 72 ℃ | 15 hēkona |
| Toronga | 72℃ | 30 hēkona |
| Toronga Whakamutunga | 72℃ | 5 min |
a.Ko te Denaturation Tuatahi (98 ℃, 5 min) ka whakatairanga i te lysis o te kiko tipu, te tuku i te DNA genomic ka taea te whakamahi mo te whakanui PCR.Kaua e whakapotohia te wa, kaua e whakaitihia te pāmahana.
b.E taunaki ana kia rite ki te uara Tm tuatahi, 2 ~ 4 ℃ teitei ake ranei i te uara Tm.He rereke te DNA polymerase whakakaha tika e whakamahia ana i roto i tenei hua mai i te Taq DNA polymerase tikanga, a he whakaritenga motuhake mo te tauhohenga whakaeneene tauhohenga; ka taea e te whakamahi o te pāmahana whakaeneene teitei te whakaiti i te whakakaha kore motuhake me te whakapai ake i te kaha o te whakakaha.Mo nga tauira uaua, ka taea te whakakaha pai ma te whakatika i te pāmahana whakaene me te whakaroa i te wa toronga.
c.Mena he ≤1 kb te roa o te hua whakakaha, kua whakaritea te wa toronga ki te 30 sec/kb;Mena he> 1 kb te roa o te hua whakakaha, kua whakaritea te wa toronga ki te 60 hekona/kb.
d.Mo nga tauira uaua, tauira ranei he iti te whakaputanga whakakaha, ka taea te whakanui i te maha o nga huringa ki te 40 -50 huringa.
Nga tono
E tika ana mo te whakakaha tika i nga kopa tipu me te tirotiro teitei o nga tauira tipu kaore he polysaccharides me te polyphenols.
Notes
Mo te whakamahi rangahau anake.Kaua e whakamahia i roto i nga tikanga tātaritanga.
1. Mo te whakakaha i te tipu kino, te whakakaha tika ranei, e taunaki ana kia whakamahia te DNA genomic kua purea hei mana pai i mua i te tiimata o te whakamatautau kia tika ai te punaha, nga timatanga me nga mahi.
2. Ko te DNA polymerase whakakaha tika i whakamahia i roto i tenei kete he kaha te mahi panui.Mēnā me mahi te whakakao TA, ka tūtohu kia purea te DNA i mua i te taapiri i te adenine.
3. Aratohu Hoahoa Tuatahi:
a.E taunaki ana ko te turanga whakamutunga i te pito 3′ o te tuatahi ko G, C ranei.
b.Me karohia nga pohehe i roto i nga turanga 8 whakamutunga i te pito 3′ o te tuatahi.c.A ape i nga hanganga makawe i te pito 3′ o te tuatahi.
d.Ko nga rereketanga o te uara Tm o te tuatahi o mua me te tuatahi whakamuri kia kaua e neke ake i te 1 ℃ me te uara Tm me whakatika ki te 60 ~ 72 ℃ (E taunaki ana te Pirimia Pirimia 5 ki te tatau i te uara Tm).
e.Ko etahi atu raupapa tuatahi karekau i te rite ki te tauira, kaua e whakaurua ina tatau ana i te uara Tm tuatahi.
f.E taunaki ana kia 40% -60% te ihirangi GC o te tuatahi.
g.Ko te tohatoha katoa o A, G, C me T i roto i te tuatahi kia rite ki te taea.A ape i te whakamahi i nga rohe he nui nga ihirangi GC, AT ranei.
h.Me karo i te noho mai o nga raupapa taapiri o nga turanga e 5 neke atu ranei i roto i te tuatahi, i waenga ranei i nga waahanga e rua, me te karo i te noho mai o nga raupapa taapiri o nga turanga e 3 neke atu ranei i te pito 3′ o nga timatanga e rua.
i.Whakamahia te mahi NCBI BLAST ki te tirotiro i te motuhake o te tuatahi hei aukati i te whakakaha kore motuhake.
