Kete Whakatauira Kiore

Cat Nama: HCR2021A

He kete tenei hua i hangaia mo te tautuhi tere o nga momo momo kiore, tae atu ki te tangohanga o te DNA me te punaha whakakaha PCR.Ka taea te whakamahi i te hua mo te whakakaha PCR tika mai i te hiku kiore, te taringa, te matimati me etahi atu kopa i muri i te wehenga ngawari e Lysis Buffer me Proteinase k.Karekau he nakunaku mo te po, tangohanga phenol-chloroform, purenga pouwae ranei, he maamaa, he whakapoto i te wa pau o nga whakamatautau.He pai te hua mo te whakakaha i nga kongakonga whaainga ki runga ki te 2kb me nga tauhohenga PCR maha ki te 3 takirua tuatahi.Ko te 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix kei roto i te DNA polymerase, Mg²⁺, dNTPs me te pūnaha parepare papaitia ki te whakarato i te kaha whakakaha teitei me te aukati aukati, kia taea ai nga tauhohenga PCR ma te taapiri i nga tauira me nga mea tuatahi me te whakahou i te hua ki te 1×.Ko te hua PCR kua whakanuia ki tenei hua he turanga rongonui "A" kei te pito 3′ ka taea te whakamahi tika mo te whakakao TA i muri i te purenga.

Waehanga

Nga Tikanga Rokiroki

Me penapena nga hua ki te -25~-15 ℃ mo te 2 tau.I muri i te whakamaroketanga, ka taea te rongoa a Lysis Buffer ki te 2~8 ℃ mo te wa poto mo te whakamahi maha, me te uru pai ina whakamahi.

Taupānga

He pai tenei hua mo te tātaritanga knockout kiore, te kitenga transgenic, te genotyping me etahi atu.

Ngā āhuatanga

1.Te mahi ngawari: kaore he take ki te tango i te DNA genomic;

2.Te tono whanui: e tika ana mo te whakakaha tika i nga momo kopa kiore.

Tohutohu

1.Te tukunga o te DNA genomic

1) Te whakarite i te lysate

Ka rite te lysate kiore kia rite ki te maha o nga tauira kiore hei whakangao (me whakarite te lysate kiko ki runga i te waahi kia rite ki te inenga me te whakauru pai mo te whakamahi), a ko te wahanga o nga reagents e hiahiatia ana mo te tauira kotahi e whai ake nei:

2) Te Whakaritenga Tauira me te Rahi

Te Whakamahi Tiu Tiu

Tangohia te rahinga o nga tauira kiko kiore i roto i nga ngongo centrifuge ma, taapirihia te 200μL o te lysate kiko hou ki ia ngongo centrifuge, vortex me te wiri, ka whakakororia i te 55 ℃ mo te 30 meneti, ka wera i te 98 ℃ mo te 3 meneti.

3) Whakanuia

Ruperupea pai te lysate me te centrifuge i te 12,000 rpm mo te 5 meneti.Ka taea te whakamahi i te supernatant hei tauira mo te whakakaha PCR.Mena ka hiahiatia te tauira mo te rokiroki, whakawhitia te supernatant ki tetahi atu ngongo centrifuge horomata ka rongoa ki te -20 ℃ mo te 2 wiki.

2.Whakanui PCR

Tango i te 2×Kiore Tissue Direct PCR Mix mai i -20 ℃ ka rewa ki te hukapapa, uru ki raro ka whakarite i te punaha tauhohenga PCR kia rite ki te ripanga e whai ake nei (mahi i runga tio):

Tuhipoka:

a) Ko te nui o te taapiri kia kaua e neke ake i te 1/10 o te punaha, a, ki te nui rawa te taapiri, ka taea te aukati i te whakakaha PCR.

Nga Tikanga PCR e manakohia ana

Tuhipoka:

a) Te pāmahana whakaene: Ma te tohu ki te uara Tm o te tuatahi, e taunaki ana kia tautuhia te pāmahana whakaene ki te uara Tm iti o te tuatahi +3~5℃.

Nga Raruraru noa me nga Whakataunga

1.Karekau he takai i whaaia

1) Hua lysis taikaha.Kōwhirihia te rahinga tino tika o te tauira, te tikanga kaua e neke ake i te 1/10 o te punaha;

2) He nui rawa te rahi o te tauira.Waimeha i te lysate kia 10 nga wa ka whakanui, ka whakaitihia ranei te rahi o te tauira me te re-lysis;

3) Ko nga tauira o te kopa kaore i te hou.E taunaki ana kia whakamahia nga tauira kiko hou;

4) He iti te kounga tuatahi.Whakamahia te DNA genomic hei whakakaha hei manatoko i te kounga tuatahi me te arotau i te hoahoa tuatahi.

2.Ko te whakakaha kore-motuhake

1) He iti rawa te pāmahana whakahiato, he tiketike rawa te tau huringa.Whakanuia te pāmahana whakaene me te whakaiti i te maha o nga huringa;

2) He tiketike rawa te kukū o te tauira.Whakaitihia te nui o te tauira, waimeha ranei te tauira kia 10 nga wa i muri i te whakakaha;

3) He iti rawa te motuhake.Arotauhia te hoahoa tuatahi.

Notes

1.Hei karo i te paheketanga i waenga i nga tauira, me whakarite nga taputapu tauira maha, ka taea te horoi i te mata o nga taputapu ki te 2% wairewa konutai hypochlorite me te kai horoi waikawa nucleic ranei i muri i ia tauira mena ka hiahiatia te whakamahi tonu.

2.E taunaki ana kia whakamahia he kopa kiore hou, kia kaua e nui rawa te rahinga tauira kia kore ai e pa ki nga hua whakakaha.

3.Me karo a Lysis Buffer i te whakamaroke i nga wa katoa, ka taea te penapena ki te 2~8 ℃ mo te wa poto mo te whakamahi maha.Mēnā ka penapena ki te pāmahana iti, ka puta pea te ua, ā, me tino rewa i mua i te whakamahi.

4.Ko te PCR Mix me karo i te hukapapa-tio, ka taea te penapena ki te 4 ℃ mo te wa poto.

5.Ko tenei hua anake mo te rangahau whakamatautau putaiao me kaua e whakamahia ki te taatai ​​haumanu, maimoatanga ranei.