PNGase F
Ko te Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) te tikanga enzymatic tino whai hua mo te tango tata katoa o nga oligosaccharides hono-N mai i nga glycoproteins.Ko te PNGase F he amidase, ka wehe i waenga i te nuinga o te GlcNAc me nga toenga asparagine o te mannose teitei, te ranu, me te oligosaccharides matatini mai i nga glycoproteins hono-N.
Taupānga
He pai tenei enzyme mo te tango i nga toenga warowaiha mai i nga pūmua.
Te whakarite me te whakaritenga
| Te ahua | Wai Taekore |
| Te purenga pūmua | ≥95% (mai i te SDS-PAGE) |
| Mahi | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | Karekau he mahi i kitea (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Āhuatanga
| nama EC | 3.5.1.52(Te whakakotahi mai i te microorganism) |
| Te taumaha ngota | 35 kDa (SDS-WAHI) |
| Ikohikohiko | 8. 14 |
| pH tino pai | 7.0-8.0 |
| Te pāmahana tino pai | 65 °C |
| Te motuhake o te papanga | Te tapahi i nga here glycosidic i waenga i te GlcNAc me nga toenga asparagine Fig.1 |
| Nga waahi tohu | glycans hono-N ki te kore he α1-3 fucose Fig. 2 |
| Nga kaiwhakahohe | DTT |
| Kaitautoko | SDS |
| Te pāmahana rokiroki | -25 ~-15 ℃ |
| Te Wera Whakakore | Ko te ranunga tauhohenga 20µL kei roto ko te 1µL o PNGase F ka whakawetohia e te heki i te 75 °C mo te 10 meneti. |
Whakaahua 1 Te motuhake o te papanga o PNGase F
Pikitia 2 Ka noho te tohu o PNGase F.
Ina hono nga toenga GlcNAc o roto ki te α1-3 fucose, kaore e taea e PNGase F te wehe i nga oligosaccharides hono-N mai i nga glycoproteins.Ka kitea tenei whakarereketanga ki nga tipu me etahi glycoproteins pepeke.
Components
|
| Waehanga | Te aro |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Te whakamaramatanga o te waeine
Kotahi te wae(U) kua tautuhia ko te nui o te whaakiki e hiahiatia ana hei tango > 95% o te warowaiha mai i te 10 µg o RNase B kua whakahekehia i roto i te 1 haora i te 37°C i roto i te rahinga tauhohenga katoa o te 10 µL.
Nga tikanga tauhohenga
1. Whakarewahia te 1-20 µg o te glycoprotein ki te wai whakaheke, ka tapirihia te 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer me te H2O (mehemea e tika ana) kia 10 µl te katoa o te rōrahi tauhohenga.
2.Whakanuia ki te 100°C mo te 10 meneti, whakamatao ki te hukapapa.
3.Tāpirihia te 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ka uru.
4.Tāpirihia te 1-2 µl PNGase F me te H2O (mehemea e tika ana) ki te hanga i te 20 µl katoa o te rōrahi tauhohenga me te uru.
5.Whakanuia te tauhohenga ki te 37°C mo te 60 meneti.
6.Mo te tātari SDS-PAGE, te tātari HPLC ranei.
