M-MLV Whakamuri Transcriptase
Ko te RevScript Reverse transcriptase ka riro mai i te hangarau hangarau ira.He teitei ake te kaha o te whakahiato cDNA, te pumau o te waiariki me te tepe pāmahana tauhohenga (tae atu ki te 60°C).Ko te hua cDNA kua whakahiato ki te 10 kb.Ka whakanui ake i te hononga o nga tauira me te pai mo te whakamuri whakamuri o nga tauira RNA me te hanganga tuarua matatini, nga ira kape iti ranei.
Waehanga
| Waehanga | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 mL | 5 mL |
Tikanga Rokiroki
Me penapena tenei hua ki te -25°C~-15°C mo te 2 tau.
Whakamaramatanga Waeine
Kotahi te waeine e whakauru ana i te 1 nmol o te dTTP ki te waikawa-kore-wairewa i roto i te 10 meneti i te 37°C ma te whakamahi i te Oligo(dT) hei timatanga.
Tauhohenga Tatūnga
1.Te whakahekenga o te tauira RNA (He mea kowhiria tenei taahiraa, ka awhina te denaturation o te tauira RNA ki te whakatuwhera i nga hanganga tuarua, ka pai ake te hua o te whenu tuatahi cDNA.)
| Waehanga | Rōrahi (μL) |
| RNase ddH kore utu2O | Ki te 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) Pūmatua Matapōkere rānei (50 μmol/L) Ranei ira motuhake (2 μmol/L) | 1 |
| 1 ranei | |
| 1 ranei | |
| tauira RNA | X a |
Tuhipoka:
1) a: RNA katoa: 1-5 ug mRNA ranei: 1-500 ng
2) Whakanuia ki te 65°C mo te 5 meneti, katahi ka whakawhiti tonu ki runga tio kia whakamatao mo te 2 meneti.He poto te centrifugation ki te kohi wai tauhohenga, tāpirihia te otinga tauhohenga whakawhiti whakamuri e whakaatuhia ana i te ripanga e whai ake nei.Whakapaipa paitia kia uru.
1.Te whakarite i te ranunga tauhohenga (20 μL rōrahi)
| Waehanga | Rōrahi (μL) |
| Te ranunga o te taahiraa o mua | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| Whakaranu dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Whakamuri Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Te aukati RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Mahia te tauhohenga i raro i nga tikanga e whai ake nei:
| Paemahana (°C) | Te wa |
| 25 °Ca | 5min |
| 42 °Cb | 15-30 meneti |
| 85 °Cc | 5min |
Tuhipoka:
1) a.Ko te whakamau i te 25°C mo te 5 meneti ka hiahiatia mo te whakamahi i nga hexamers matapōkere.Tena koa pekehia tenei taahiraa ina whakamahi koe i te Oligo (dT)18ranei Gene Specific Primer.
2) b.Ko te 42°C te pāmahana whakamuri whakamuri, Mo nga tauira he uaua nga hanganga tuarua, he nui te ihirangi GC ranei, e taunaki ana kia piki ake te pāmahana tauhohenga ki te 50-55°C.
3) c.Te whakamahana i te 85°C mo te 5mins ki te whakakore i te transcriptase whakamuri.
4) Ka taea te whakamahi tika i te hua i roto i nga tauhohenga PCR, qPCR ranei, ka rongoa ranei ki te -20 ° C mo te rokiroki mo te wa poto.E taunaki ana ki te huri i nga hua me te penapena i te -80 ° C mo te rokiroki mo te wa roa.A ape i te whakamaroke i nga wa katoa.
5) He pai te hua mo te kotahi-taahiraa RT-qPCR, e taunaki ana kia taapirihia te 10-20 U whakamuri transcriptase mo ia punaha tauhohenga 25μL, ka piki haere ranei te nui o te transcriptase whakamuri kia rite ki te ahuatanga.
Notes
1.Tena koa kia ma te waahi whakamatautau;Me mau nga karapu ma me nga kanohi kanohi i te wa e mahi ana.Ko nga kai pau katoa e whakamahia ana i roto i te whakamatautau me noho kore utu he RNase kia kore ai e poke te RNase.
2.Me mahi nga tikanga katoa ki runga tio hei aukati i te paheketanga o te RNA.
3.Ko nga tauira RNA o te kounga teitei e taunaki ana hei whakarite i te kaha o te tuhi whakamuri.
4.Ko tenei hua mo te rangahau anake.
5.Tena koa me mahi me nga koti taiwhanga me nga karapu tuku, mo to haumaru.
