Kete Mini Tangohanga DNA
Ko tenei kete ka tango i te punaha papaa pai me te hangarau purenga poutini silica gel, ka taea te whakahoki mai i te 70 bp - 20 kb nga kongakonga DNA mai i nga momo kukū o TAE, TBE agarose gel ranei.Ka taea e te pou whakauru DNA te whakauru i te DNA i raro i te ahua tote nui.I tua atu, ka taea e te kete te purei tika i nga kongakonga DNA mai i nga hua PCR, nga punaha tauhohenga enzymatic, nga hua DNA parakore ranei i riro mai i etahi atu tikanga, me te tango i nga poke penei i te pūmua, etahi atu puhui waro, katote tote parakore me nga mea tuatahi oligonucleotide.Ka taea te whakarite kia oti te purenga i roto i te 10-15min.Ko te DNA kua purea ka taea te whakamahi tika mo te herenga, te hurihanga, te keri enzyme, in vitro transcription, PCR, sequencing, microinjection, etc.
Nga tikanga rokiroki
Rokiroki i te -15 ~ -25 ℃ me te kawe i te pāmahana rūma.
Waehanga
| Waehanga | (100 rxns) |
| Pupuri GDP | 80 ml |
| Kaipupuri GW | 2 × 20 ml |
| Whakawhanawhana | 20 ml |
| Nga Tiwae Mini DNA Pure-G | 100 |
Pupuri GDP:He parepare here DNA.
Pūrei GW:Te horoi horoi;tāpirihia te waihā pūmau mā te rōrahi kua tohua ki te pounamu i mua i te whakamahi.
Pūrei Whakawhana:Whakawhanawhana.
Nga Tiwae Mini DNA Pure-G:Ko nga pou whakauru DNA.
Ngongo Kohinga 2 ml:Ngongo kohinga mo te filtrate.
Rauemi Kua Whakaritea
1.5 ml ngongo kua whakamaroketia, te waihano tino me te isopropanol (ka ≤100 bp te wahanga DNA, taapirihia kia 1 rōrahi
isopropanol ki te 1 rōrahi gel), pati wai.
Tukanga Whakamatau
Taapirihia he 80 ml o te waihano hei waimeha i te Buffer GW i runga i te tohu i mua i te whakamahi, rongoa ki te pāmahana rūma.
Hangaia
1. otinga tauhohenga PCR
Kaupapa tangohanga ra: Tāpirihia he riterite te rōrahi Buffer GDP PCR kaupapa whakaora otinga tauhohenga:Tāpirihia kia 5 nga wa o te rōrahi Buffer
2. GDP Tātaihia te rōrahi o te rā(100 μl rite 100 mg)
Whakarewahia te kiri
3. Whakawerahia i te 50 ~ 55℃
4. Herea Horoi
Tāpirihia te 300 μL o Buffer GDP*
Tāpirihia te 700 μL o Buffer GW
Tāpirihia te 700 μL o Buffer GW
5. Elute
Taapirihia te 20 – 30μL o te Elution Buffer, te wai whakaheke ranei
Notes* PCR tauhohenga whakaora wai me te kore tenei taahiraa
He kaupapa tangohanga kaera
1. Whai muri i te electrophoresis DNA mo te wehewehe i nga kongakonga DNA, tangohia te karaehe kotahi o te kongakonga DNA mai i te kaera agarose i raro i te rama UV.E taunaki ana ki te whakamahi i te pepa mimiti ki te tango i te makuku o te ra me te whakaiti i te rahi o te poro kaera ma te tango atu i te agarose ka taea e koe.Paunatia te poro kiri (kaore he ngongo microcentrifuge) hei tatau i tona rōrahi: Ko te rōrahi o te 100 mg gelslice he āhua 100 μL, ki te whakaaro ko te kiato he 1g/ml.
2. Tāpirihia he riterite te rōrahi Buffer GDP, incubate i te 50~55 ℃ mo te 7-10 min (kia rite ki te rahi o te reera, whakatikahia te wa incubation tae noa ki te rewa katoa o te reera).Hurihia te ngongo kia 2 nga wa i te wa o te heki.
Δ Ko te taapiri o nga pukapuka 1-3 o te Buffer GDP e kore e awe i te kaha whakaora DNA.Mena ka whakahokia mai te wahanga DNA <100 bp, me tapiri kia 3 nga pukapuka o te Buffer GDP;ka rewa rawa te poro o te reera, whakauruhia kia 1 te rōrahi o te isopropanol ka uru pai, katahi ka haere tonu ki te mahi e whai ake nei.
3. Whakanuia poto ki te kawe mai i te tauira ki raro o te ngongo, whakauruhia te FastPure DNA Mini Columns-G ki roto i te Kohinga Kohinga 2 ml, me ata whakawhiti te otinga kia 700 μL kotahi te
te wa ki nga pou filtration, centrifuge i te 12,000 rpm (13,800 X g) mo te 30-60 hekona.
4. Makahia te filtrate me te tapiri i te 300 μL o te Buffer GDP ki te pou, whakakororia i te pāmahana rūma mo te 1 min, te centrifuge i te 12,000 rpm (13,800 X g) mo te 30-60 hēkona.
5. Makahia te filtrate me te taapiri i te 700 μL o te Buffer GW (tirohia mena kua taapirihia te waihano tino i mua atu!) ki te pou, whakahiato ki te 12,000 rpm (13,800 X g) mo te 30-60 hēkona.
Δ Tena koa taapirihia he Buffer GW huri noa i te pakitara o te pou whakauru, taapirihia ranei he uhi whakamuri a Buffer GW ka uru ki raro mo te 2 - 3 nga wa hei awhina i te horoi i te tote e piri ana ki te pakitara ngongo.
6. Whakahokia te taahiraa 5.
Δ Ko te whakawiri me te Buffer GW kia rua nga wa ka taea te whakarite kia tangohia katoatia te tote me te whakakore i te paanga ki nga whakamatautau ka whai ake.
7. Makahia te filtrate me te centrifuge te tīwae kau i te 12,000 rpm (13,800 X g) mo te 2 min.
8. Whakauruhia te pou ki roto i te ngongo microcentrifuge 1.5 ml ma, ka tapirihia te 20 - 30 μL o te Elution Buffer ki te pokapū o te kirirangi o te pou, whakamauhia mo te 2 min, katahi ka centrifuge i te 12,000 rpm (13,800 X g) mo te 1 min.Makahia te pou, penapena te DNA kua whiwhi ki te -20 .
Δ Te whakawhiti i te supernatant o te taahiraa 8 ki te poupou ki te whakaheke ano me te whakamahana i te Elution Buffer ki te 55 (ina te wahanga DNA >3 kb) ka awhina pea ki te whakapiki ake i te kaha whakaora.
He kaupapa whakaora hua PCR
E tika ana tenei kawa ki te purei i nga kongakonga DNA mai i nga hua PCR, te punaha tauhohenga enzymatic me etahi atu hua parakore DNA (tae atu ki te DNA ira).Ka taea e tenei otinga te tango i nga momo nucleotides, nga mea tuatahi, nga dimer tuatahi, nga ngota ngota tote, nga whākōkī me ētahi atu poke.
1. Pokahia nga hua PCR poto, te otinga tauhohenga enzymatic, me etahi atu hua parakore DNA.Whakatau tatahia te rōrahi ki te pipette ka whakawhiti ki te ngongo 1.5 ml, 2 ml ranei.Tāpirihia te ddH2O tae noa ki te rōrahi ki te 100 μL;i te mea mo te DNA genomic he nui te kukū, ko te waimeha ki te 300 μL me te ddH2O ka pai ake te pai o te whakaora.
2. Taapirihia kia 5 nga pukapuka o te Buffer GDP, uru pai ma te hurihuri, ma te poikiri ranei.Mena he maramara DNA o te paanga >100 bp, me tapiri atu he 1.5 pukapuka (tauira + Buffer GDP) o te waihano.
3. Whakauruhia te poupou ki roto i te ngongo kohinga, whakawhitia te mixtrue ki te pou, centrifuge i te 12,000 rpm (13,800 ×g) mo te 30 – 60 hekona.Mēnā he >700 µL te rōrahi o te otinga whakauru, whakahokia te tīwae adsorption ki roto i te ngongo kohinga, whakawhitia te toenga otinga ki te tīwae adsorption, me te centrifuge i te 12,000 rpm (13,800 × g) mo te 30 – 60 hēkona.
4. Ko te mahi e whai ake nei e pa ana ki te taahiraa 5 – 8 o te kaupapa tangohanga 08- 1/Gel.
Nga tono
He maha nga rereketanga o te TAE or TBE agarose gel;Ko nga hua PCR, nga punaha tauhohenga enzymatic, etahi atu hua DNA parakore ranei ka whiwhi i nga tikanga rereke.Ko nga kongakonga kua ora mai i te70 bp -20 kb.
Notes
Mo te whakamahi rangahau anake.Kaua e whakamahia i roto i nga tikanga tātaritanga.
1. Taapirihia he 80 ml o te waihano hei waimeha i te Buffer GW i runga i te tohu i mua i te whakamahi, rongoa ki te pāmahana rūma.
2. Mena he ngawari te pupuhi o te GDP Buffer i roto i te rokiroki iti-mahana, ka taea te whakanoho ki te waahi o te ruma mo tetahi wa i mua i te whakamahinga.Mena e tika ana, ka taea te whakamahana i roto i te kaukau wai 37 ℃ tae noa ki te rewa katoa o te rerenga, katahi ka taea te whakamahi i muri i te whakaranu.
3. Whakaritea te pāmahana pati wai ki te 50 ~ 55 ℃ i mua.
4. I roto i te kaupapa 08-1/Gel tangohanga htaka 1, ko te whakaiti i te rahi o te poro kiri ka tino whakaitihia te wa memeha me te whakanui ake i te pai o te whakaora (He ngawari te whakamaarama i te DNA Linearized ina ka kitea tonutia i te wera nui).Kaua e tukuna te kiri DNA ki te UV mo te wa roa, na te mea ko te rama ultraviolet ka pakaru te DNA.
5. Whakamutua te reera i roto i te 08- 1/Hakarere tangohanga Gel i te taahiraa 2 katoa, ki te kore ka tino pa te kaha whakaora DNA.
6. Preheat Elution Buffer, ddH2O ranei ki te 55 ℃ , he pai ki te whakapai ake i te pai o te whakamaarama DNA.E taunaki ana kia penapena te DNA i roto i te eluent 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 – 8.5.
