RNA paerua (dsRNA) ELISA KIT

Ko tenei kete he Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e hono ana me te punaha biotin-Streptavidin, mo te inenga ine o te dsRNA me te roa i runga ake i te 60 turanga takirua(bp), ahakoa te raupapa.Ko te pereti kua pania ki te anti-dsRNA antibody.Ko te dsRNA kei roto i te tauira ka taapirihia ka herea ki nga paturopi kua pania ki nga puna.Na ka taapirihia te anti-dsRNA antibody biotinylated ka herea ki te dsRNA i roto i te tauira.I muri i te horoinga, ka taapirihia te HRP-Streptavidin ka herea ki te anti-dsRNA antibody Biotinylated.I muri i te hekitanga ka horoia a HRP-Streptavidin.Kātahi ka tāpirihia te otinga tïpako TMB ka whakatikitia e te HRP kia puta he hua tae kahurangi ka huri ki te kowhai i muri i te taapiri i te otinga aukati waikawa.Ko te kiato o te kowhai he rite ki te nui o te dsRNA i mau ki te pereti.Ka inehia te urunga ki te 450 nm.

Taupānga

Ko tenei kete mo te ine ine o te toenga dsRNA.

Nga waahanga kete

Rokiroki me te Pumau

1. Mo te kete kaore i whakamahia: Ka taea te penapena te kete katoa ki te 2 ~ 8 ℃ i roto i te oranga o te papa.Me karohia te marama kaha mo te pumau o te rokiroki.

2. Mo te kete kua whakamahia: Kia whakatuwherahia te microplate, tena koa kapihia nga puna kore i whakamahia ki te kaitarai pereti ka hoki mai ki te putea konumohe kei roto te putea whakamaroke, te hiri-hiri i te putea konumohe ka hoki wawe ki te 2 ~ 8 ℃ i muri i te whakamahinga.Ko etahi atu reagents me whakahoki wawe ki te 2 ~ 8 ℃ i muri i te whakamahinga.

Nga Rauemi E Hiahia Engari Kaore i Tukua

1. Kaipupuri Microplate me te tātari 450±10nm (he pai ake mena ka kitea i te 450 me te 650 nm te roangaru).

2. Te whakawiri moroiti.

3. Nga tohutohu RNase-kore me nga ngongo centrifuge.

Tūtohiripo Mahi

I mua i to tiimata

1. Kawea mai nga waahanga kete katoa me nga tauira ki te pāmahana rūma (18-25 ℃) i mua i te whakamahi.Ki te kore e pau te kete i roto i te wa kotahi, me tango noa nga takai me nga reagents mo te whakamatautau o naianei, ka waiho nga toenga takai me nga reagents i roto i nga ahuatanga e tika ana.

2. Horoi parepare: waimeha 40mL o te 20x te parepare horoi kukū ki te 760mL o te wai whakaheke iona, te wai parakore ranei hei whakarite i te 800mL o te 1x te parepare horoi.

3. Paerewa: miro poto, whakahiahia ranei te otinga rakau i mua i te whakamahi.Ko te kukū o nga paerewa e wha e whakaratohia ana ko te 5ng/μL.Mo nga paerewa UTP me te pUTP dsRNA, me waimeha i te otinga rakau ki te 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL me te STE buffer hei tuhi i te pihi paerewa.Mo nga paerewa N1-Me-pUTP dsRNA, me waimeha i te otinga rakau ki te 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL me te STE buffer hei tuhi i te pihi paerewa.Mo te paerewa 5-OMe-UTP dsRNA, me waimeha i te otinga rakau ki te 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL me te STE buffer hei tuhi i te pihi paerewa.E taunaki ana matou ka taea te whakaheke i nga paerewa kia rite ki nga mahere e whai ake nei:

4. Hangarau whakakitenga biotinylated me te otinga mahi HRP-streptavidin: miro poto me te centrifuge te otinga kararehe i mua i te whakamahi.Waimeha ki te kukū mahi me te waimeha waimeha.

5. TMB substate: whakahiatohia te inenga e hiahiatia ana o te otinga me nga tohutohu kua werohia, kaua hoki e maka ano te toenga wairewa ki roto i te ipu.He tairongo te TMB substate ki te marama, kaua e tukuna te TMB substrate ki te marama mo te wa roa.

Te whakamahi kawa

1. Whakatauhia te maha o nga takai e hiahiatia ana mo te whakamatautau.Whakauruhia nga takai ki roto i nga papa hei whakamahi.Ko nga toenga pereti karekau i whakamahia i roto i tenei whakamatautau me kiki ano ki roto i te putea me te whakamaroke.Katia kia pai te putea mo te whakamatao.

2. Tāpirihia he 100μL ia waimehatanga o te paerewa, te paatea me nga tauira ki roto i nga puna e tika ana.Hipokina ki te kaitapa pereti.Horoihia mo te 1 haora i te pāmahana rūma me te wiri i te 500rpm.Me waimeha nga tauira ki te kaitarai STE ki te kukū e tika ana mo te whakamatautau tika.

3. Te taahiraa horoi: Whakapohia te wairewa ka horoi ki te 250μL horoi horoi ki ia puna ka waiho mo te 30s.Whakakorea rawatia te parapara horoi ma te kapo i te pereti ki runga pepa mimiti.Horoi rawa kia 4 nga wa.

4. Tāpirihia he 100μL o te otinga mahi antibody detection biotinylated ki ia puna.Hipokina ki te kaihiri paraharaha.Horoihia mo te 1 haora i te pāmahana rūma me te wiri i te 500rpm.

5. Whakahokia te taahiraa horoi.

6. Tāpirihia he 100μL o te otinga mahi HRP-streptavidin ki ia puna.Hipokina ki te kaitapa pereti.Horoihia mo te 30 meneti i te pāmahana rūma me te wiri i te 500rpm.

7. Whakahokia ano te taahiraa horoi.

8. Taapirihia he 100μL o te otinga tïpako TMB ki ia puna.Hipokina ki te kaitapa pereti.Whakanuia mo te 30 meneti i te RT Tiaki i te marama.Ka puru te wai ma te taapiri i te wairewa tïpako.

9. Tāpirihia he 50μL o te otinga mutu ki ia puna.Ka kowhai te wai ma te taapiri o te otinga mutu.Na ka whakahaere i te kaipanui microplate ka whakahaere ine i te 450nm tonu.

Te Tatautanga o nga Hua

1. Wawaengatia nga panui taarua mo ia paerewa, mana whakahaere me nga tauira ka tango i te kiato whatu paerewa kore toharite.Hangaia he ānau paerewa me te urunga ki te tuaka poutū(Y) me te kukū dsRNA ki te tuaka whakapae(X）).

2. E taunaki ana kia mahia te tatauranga me te rorohiko-rorohiko-a-rorohiko-a-rorohiko-a-raupapa-a-rorohiko penei i te tohunga pihi 1.3, ELISA Calc ranei i roto i te 5, 4 ranei te tawhā tauira pai kore-raina.

Mahi

1. Tairongo:

te rohe iti o te kitenga: ≤ 0.001pg/μL (mo te UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (mo te 5-OMe-UTP-dsRNA).

te rohe iti o te ine: 0.0156 pg/μL (mo te UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (mo te N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (mo te 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Tika: CV o Intra-Assay ≤10%, CV o Inter-Assay ≤10%

3. Whakaora:80%~120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(mo 5-OMe-UTP-dsRNA).

Nga whakaaro

1. TMB tauhohenga pāmahana me te wa he tino nui, tēnā whakahaere ratou rite ki te ako tino.

2. Kia pai ai te whakaputanga o te whakamatautau me te tairongo, he mea nui te horoi tika i nga pereti hei tango i te taikaha o nga tauhohenga kore-reagent.

3. Me uru katoa nga reagents i mua i te whakamahi me te karo i nga bumbles i te wa o te tauira me te taapiri o nga reagents.

4. Mēnā kua hanga ngā tioata i roto i te parepare horoi kukū (20x), whakamahana ki te 37 ℃ ka uru ata kia rewa katoa nga tioata.

5. A ape i te whakamatautau i nga tauira kei roto te Sodium Azide (NaN3), i te mea ka taea e ia te whakakore i te mahi HRP ka iti te whakaaro o te nui o te dsRNA.

6. A ape i te poke RNase i te wa o te whakamatautau.

7. Ka taea hoki te whakahaere i te paerewa/tauira, antibody detection me te SA-HRP i te RT me te kore e wiri, engari tera pea ka heke te tairongo o te kitenga ma te kotahi-pa.Mo tenei take, ka tūtohu matou kia whakahekehia nga paerewa UTP me te pUTP dsRNA mai i te 2pg / μL, me whakakorehia nga paerewa N1-Me-pUTP dsRNA mai i te 4pg / μL me te 5-OMe-UTP dsRNA paerewa me diluted mai i te 8pg / μL.I tua atu, incubate HRP-streptavidin otinga mahi mo te 60min i te pāmahana rūma.Kaua e whakamahi i te wiriwiri ipu, na te mea ka puta he hua karekau.

Hua angamaheni

1. Raraunga ānau paerewa

2. Te tataunga pihi paerewa

3. Awhe rapunga raina: 0.0312- 1pg/μL